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Enzymkinetik
Protokoll zum 3. Versuchstag
Lehrveranstalter Prof. Dr. Achazi Durchführung Freitag, 15.05.2009, Kurs B Thema Enzymkinetik Protokollführung Julia Krüger, Toni Wendt, Ines Welzel
Einleitung zur Enzymkinetik Zum Thema Enzymkinetik besteht die Möglichkeit dies anhand eines Neurotransmitters, der aus den großen Muskeln eines Krebses gewonnen werden kann, zu untersuchen. Durch Homogenisieren und Abzentrifugieren von Überstand und Pellet kann aus den Muskeln Acetylcholinesterase gewonnen werden. Es ist die Grundaktivität mittels Verdünnungsreihen zu bestimmen und schließlich im Photometer die Enzymkinetik der Acetylcholinesterase zu bestimmen.
Die Acetylcholinesterase ist ein Biokatalysator, der Acetylcholin zu Essigsäure und Cholin hydrolisiert. Das Acetylcholin ist ein Neurotransmtter, der an der neuromuskulären Endplatte gebunden ist und frei im synaptischen Spalt zur Reaktion mit cholinergenen Synapsen vorkommt. Acetylcholin bewirkt an nicotinischen Acetylcholinrezeptoren einen Einstrom von Natrium und einen Ausstrom von Kalium an der postsynaptischen Membran, so daß ein Aktionspotential (nach Depolarisation) die Kontraktion der Muskelfaser bewirken kann. Wird das Acetylcholin nicht durch die seine Esterase abgebaut, kommt es zum „Dauertremor“, d. h. die Natrium- und Kaliumkanäle bleiben aktiv und die Depolarisation der Membran geht nicht mehr zurück, somit kommt es zur Muskelschwäche und vorzeitigem Exitus.
Hinsichtlich der Enzymkinetik kann ausgeführt werden, daß eine chemische Reaktion meist nur dann stattfindet, wenn die Reaktionsenthalpie negativ ist. Sind Druck und Temperatur gleich, hängt der Wert der Reaktionsenthalpie nur von den Reaktionspartnern und ihren Konzentrationen ab. Sind Druck und Temperatur zu niedrig, im lebenden System sind diese sehr eingegrenzt, benötigt eine Reaktion zum Starten einen Katalysator, der das Erreichen des Übergangszustandes ermöglicht: ein Enzym. Ein Enzym hat nur Einfluß auf die Kinetik (Geschwindigkeit) einer Reaktion, thermodynamisch unmögliche Reaktionen kann es jedoch auch nicht anregen. Im Jahre 1913 beschrieben Leonor Michaelis und Maud Menten das Modell der enzymatisch katalysierten Reaktion: Enzym (E) und Substrat (S) werden in ihrer Reaktion von einer Geschwindigkeitskonstanten beeinflußt und bilden einen Enzym-Substrat-Komplex, der wieder zu E und S zerfallen kann oder über eine weitere Geschwindigkeitskonstante zu Enzym und Produkt (P) reagieren kann. Diese Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der Substratkonzentration: Die Geschwindigkeit der Reaktion ist die Maximalgeschwindigkeit dividiert durch die Summe der Substratkonzentration und der Michaelis-Menten-Konstanten. Letztgenannte ist die Substratkonzentration, bei halber Reaktionsgeschwindigkeit. Bei geringer Substratkonzentration ist die Reationsgeschwindigkeit proportional zur Substratkonzentration, je mehr Substrat dann jedoch vorhanden ist, desto langsamer wird die Reaktion, bis sie eine Maximalgeschwindigkeit erreicht, beider das Enzym eben substratgesättigt ist. Ist die Geschwindigkeitskonstante Enzym und Produkt zu Enzym-Substrat-Komplex sehr viel kleiner als vom Komplex zurück zu den Edukten, so ist die M.-M.-Konstante ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat (kleine KM, größere Affinität). Unter folgenden Voraussetzungen wird die in Rede stehende Kinetik gut beschrieben: S-Konzentration ist größer als E-Konz., am meisten liegt E.-S.-Komplex vor Enzym und Produkt reagieren kaum zum Komplex zurück Bildungsgeschwindigkeit ist fast Zerfallsgeschweindigkeit des Komplexes und sehr langsam ist der Zerfall des Komplexes in Enzym und Produkt (geschwindigkeitsbestimmend) Grob hergeleitet ist die M.-M.-Konstante die Summe der Geschwindigkeitskonstanten Komplex reagiert zu Enzym und Produkt und Komplex reagiert zu Enzym und Substrat dividiert durch Enzym und Substrat reagiert zu Komplex. Hierinnen werden die Konzentrationen eingesetzt und man erhält Komplexkonzentration ist gleich Enzymgesamtkonzetration multipliziert mit Substratkonzentration dividiert durch die Summe der Substratkonzentration und M.-M.-Konstante, wobei diese letztgenannte ja eben die Konzentrationen Enzym mal Substrat durch Komplex ist. Wird nun die Komplexkonzentration ersetzt durch Reaktionsgeschwindigkeit dividiert durch Geschwindigkeitskonstante von Komplex zu Enzym und Produkt, so erhält man nach Umformen die Katalysegeschwindigkeit. Da die maximale Geschwindigkeit erreicht ist, wenn alle katalytischen Bindungsstellen am Enzym mit Substrat gesättigt sind, kann nun für max.V eingesetzt werden: Geschwindigkeitskonstante Komplex zu Enzym und Produkt mal Enzymgesamtkonzentration, dann ergibt sich die bekannte M.-M.-Gleichung (s. Streyer, 6. Auflage, S. 242 ff.) M.-M.-Konstante und Maximalgeschwindigkeit können experimentell bestimmt werden: Geschwindigkeit zu Substratkonzentration ergibt einen hyperbolischen Kurvenverlauf, aus dem Konstante und Maximalgeschwindigkeit computermäßig berechnet werden können. Es gibt zur Überprüfung noch weitere Auftragungsmöglichkeiten: - Lineweaver-Burk: reziproke M.-M.-Gleichung (1/V=1/max.V + M.-M.-Konstante/ Produkt max.V und Substratkonzentration), X-Achsenschnittpunkt der Geraden ist -1/KM und Y-Schnittpunkt ist 1/max.V; aufgetragen wird 1/V zu 1/S-Konz. - Eadie-Hofstee: aufgetragen V zu V/S-Konz.,Y-Schnittpunkt ist max.V und X-Schnittpunkt max.V/M.-M-Konstante, die Steigung der Geraden entspricht der negativen M.-M.-Konstante - Hanes: V/S-Konz. zu S-Konz., Y-Schnittpunkt ist M.-M.-Konstante/max.-V und X-Schnittpunkt ist negative M.-M.-Konstante. - direkte lineare Auftragung ideal: V zu -Substratkonzentration, dies ergibt dann mehrere Geraden, die sich ideal in einem Punkt im ersten Quadranten schneiden und dessen Wertepaare M.-M.-Konstante und Geschwindigkeit sind. Abweichungen von einem hyperbolischen Verlauf werden hierbei aber nicht festgestellt, hier kann nicht gesagt werden, ob M.-M.-Kinetik vorliegt oder nicht. Um einer starken Verzerrung der statistischen Fehler beim Auftragen entgegen zu wirken ist Hanes oder Eadie-Hofstee als Auftragungsmethode zu bevorzugen.
Enzyme können nun aber auch selbst beeinflußt werden, indem sie z. B. gehemmt werden:
Beantwortung der Fragen: - wie definieren Sie einen Biokatalysator? Ein Biokatalysator ist ein Enzym bzw. Ferment, es kommt unverändert aus einer Reaktion heraus. Überwiegend handelt es sich um Proteine mit Ausnahme der katalytisch wirksamen RNA. Katalysatoren setzen die Aktivierungsenergie einer Reaktion herab, damit unter den in lebenden Zellen herrschenden Bedingungen chemische Reaktionen innerhalb „lebenserhaltender“ Zeit ablaufen können. - Was sind Coenzyme, was sind Cosubstrate? Kennen Sie noch andere Faktoren, die für die Aktivität eines Enzyms notwendig sind? Coenzyme sind komplexe organische Moleküle, nicht proteinartige Bestandteile, die vorübergehend – selten auch kovalent – an den Proteinanteil binden (Vitamine u. ä.). Cosubstrate sind Bestandteile, die sich immer wieder neu an das entsprechende Enzymprotein anlagern, umgesetzt werden und dann das Enzym wieder verlassen ( FAD, NADH etc.). Weitere Faktoren, die noch für die Aktivität eines Enzyms notwendig sind bzw. Einfluß auf das Enzym nehmen, sind z. B. die Umgebung, wie Temperatur, Vorhandensein von bsp. Metallionen, pH-Wert. Desweiteren ist für eine enzymatische Reaktion wichtig, ob das Enzym weitere Bindungsstellen besitzt, die räumlich vom aktiven Zentrum getrennt sind, an denen ein allosterischer Inhibitor (Hemmer) ansetzen kann, so daß z. B. keine Produktbildung erfolgt. Durch diesen so genannten allosterischen Effektor (positiv/negativ) wird die Konformation des Enzyms geändert, die dann ggf. eine weitere Reaktion zuläßt oder verhindert. So gibt es die kompetitive Hemmung, bei der Inhibitor und Substrat um dieselbe Bindungsstelle konkurrieren oder die nicht kompetitive, bei der der Inhibitor wie gesagt die Konformation des Enzyms derart verändert, daß Substrat nicht mehr aufgenommen werden kann. Dann gibt es noch prosthetische Gruppen, die dauerhaft mit dem Enzym verbunden sind, wie z. B. die Hämgruppen, die an das Hämoglobin gebunden sind. - Wie wirkt ein Enzym auf eine exergonische Reaktion und wie sieht das Energiediagramm einer solchen Reaktion aus? Exergonisch heißt, daß freie Energie bei einer chemischen Reaktion abgegeben wird,die Reaktionsteilnehmer bilden weniger energiereiche Produkte, ΔG ist negativ. Aufgetragene freie Energie zum Reaktionsverlauf nimmt ab. Das Enzym wirkt nicht auf die Differenz der freien Energie, es erniedrigt nur die Aktivierungsenergie. - Was beschreibt die Michaelis-Menten-Konstante? Die Michaelis-Menten-konstante beschreibt die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat, d. h. die Stärke, mit der das Substrat gebunden wird. Bei halber Maximalgeschwindigkeit der enzymgesteuerten Reaktion, entspricht die Substratkonzentration der KM . Aufgetragen Reaktionsrate zu Substratkonzentration verläuft die Reaktion mit Enzym asymptotisch zu einer Maximalgeschwindigkeit, dem Maß für die Aktivität des Enzyms. Sobald das Enzym mit Substrat gesättigt ist, flacht die Kurve nämlich ab, Sättigungskurve. - Welche Formen der Enzyminhibition kennen Sie, beschreiben Sie die Unterschiede! Inhibition heißt Hemmung. Inhibitoren für Enzyme können in der Zelle selbst vorkommen oder von außen zugeführt werden. Es gibt irreversible und reversible Hemmung, irreversible binden kovalent am Enzym und verhindern die weitere chemische Katalyse ( Diisopropylfluorophosphat, blockiert Serin im aktiven Zentrum des Trypsinenzyms ). Die reversible läßt sich in kompetitive und nicht kompetitive Hemmung unterteilen, so bindet im ersten Fall der Inhibitor im aktiven Zentrum des Enzyms nicht kovalent. Wird die Konzentration des Inhibitors herabgesetzt gibt er die Bindungsstelle wieder frei. Im zweiten Fall der nicht kompetitiven Hemmung bindet der Inhibitoran an einem anderen Bereich, nicht im aktiven Zentrum, und führt eine Konformationsänderung des Enzyms herbei, so daß ebenfalls die Geschwindigkeit der Produktbildung herabgesetzt wird. Wie kann durch allosterische Hemmung ein Stoffwechselablauf geregelt werden? Ein Stoffwechselablauf wird hauptsächlich durch Enzyme geregelt. Ein Enzym kann von inaktiver Form in aktive Form durch Konformationsänderung wechseln, so daß dann die richtige Raumstruktur gegeben ist, um das Substrat zu binden. So haben solche Enzyme zumeist ein allosterisches Zetrum, welches räumlich am aktiven Zentrum getrennt ist. Allosterische Hemmung – άλλος anders und στέρεος räumlich – bedeutet, daß das Enzym in seiner Aktivität durch seine Änderung der Konformation in eine nicht bindungsfähige Raumstruktur übergeht. Hierzu binden dann regulatorische Moleküle/allosterische Effektoren am entsprechenden Zentrum des Biokatalysators und stabilisieren seine inaktive Form. Somit wird die Katalyse, die den Stoffwechsel regelt allosterisch gehemmt. Es gibt nun noch Enzyme aus einem bzw. mehreren Polypeptiden, hierdurch erfolgt die Substratbindung im ersten Fall zuerst mit steigender Substratkonzentration stark zu und flacht dann ab, hyperbolischer Kurvenverlauf bei der Auftragung von Reaktionsrate zu Substratkonzentration. Im zweiten Fall, das Enzym hat mehrere Untereinheiten, hat die Kurve einen sigmoiden Verlauf, d. h. die Reaktionsrate ist zu beginn mit steigender Substratkonzentration relativ gering, nimmt dann jedoch empfindlich in einem bestimmten Bereich zu, sobald die Substratkonzentration sich auch nur gering ändert und läuft dann flach gegen die maximale Umsatzrate aus. Aufgrund dieser heftigen Reaktion auf geringe Sustratkonzentrationsänderung ist es für den Stoffwechselablauf wichtig, daß er allosterisch gehemmt werden kann. Warum verhindert starke Säure die Katalyse eines Enzyms? Es verhält sich so, daß die meisten enzymkatalysierten Reaktionen vom pH-Wert des umgebenden Mediums abhängen, jedes Enzym hat seinen präferierten pH-Wert, bei dem es am aktivsten ist. Die entsprechenden Gruppen: Amino-, Carboxyl- dissoziieren jeweils,indem sie z. B. in saurem Milieu H+ aufnehmen und so kann beispielsweise die Carboxylgruppe gänzlich zu -COOH dissoziieren und ist damit ungeladen und nicht mehr mit anderen Gruppen des Proteins in Wechselwirkung treten. Somit kann die Konformation des Enzyms derart gestört werden, daß es nicht mehr mit seinem Substrat binden kann.
b) Herausarbeiten der Fragestellung:
Wie weit oben ausgeführt, ist die Acetylcholinesterase ein Enzym, welches im synaptischen Spalt und der motorischen Endplatte Acetylcholin hydrolisiert. Acetylcholin wirkt als Neurotransmitter. Aus den Schwanzmuskeln des Flußkrebses kann es gewonnen werden, dabei ist es interessant zu erfahren, ob es vermehrt an der motorischen Endplatte gebunden ist (Extraktionsverwertung des Pellets), oder auch im synaptischen Spalt (Messung des Überstandes) nachgewiesen werden kann, gibt es bereits Literaturwerte dazu und wie ist der Wirkmechanismus?
Lehrveranstalter Prof. Dr. Achazi Durchführung Freitag, 15.05.2009, Kurs B Thema Enzymkinetik Protokollführung Julia Krüger, Toni Wendt, Ines Welzel
- Einleitung:
Einleitung zur Enzymkinetik Zum Thema Enzymkinetik besteht die Möglichkeit dies anhand eines Neurotransmitters, der aus den großen Muskeln eines Krebses gewonnen werden kann, zu untersuchen. Durch Homogenisieren und Abzentrifugieren von Überstand und Pellet kann aus den Muskeln Acetylcholinesterase gewonnen werden. Es ist die Grundaktivität mittels Verdünnungsreihen zu bestimmen und schließlich im Photometer die Enzymkinetik der Acetylcholinesterase zu bestimmen.
Die Acetylcholinesterase ist ein Biokatalysator, der Acetylcholin zu Essigsäure und Cholin hydrolisiert. Das Acetylcholin ist ein Neurotransmtter, der an der neuromuskulären Endplatte gebunden ist und frei im synaptischen Spalt zur Reaktion mit cholinergenen Synapsen vorkommt. Acetylcholin bewirkt an nicotinischen Acetylcholinrezeptoren einen Einstrom von Natrium und einen Ausstrom von Kalium an der postsynaptischen Membran, so daß ein Aktionspotential (nach Depolarisation) die Kontraktion der Muskelfaser bewirken kann. Wird das Acetylcholin nicht durch die seine Esterase abgebaut, kommt es zum „Dauertremor“, d. h. die Natrium- und Kaliumkanäle bleiben aktiv und die Depolarisation der Membran geht nicht mehr zurück, somit kommt es zur Muskelschwäche und vorzeitigem Exitus.
Hinsichtlich der Enzymkinetik kann ausgeführt werden, daß eine chemische Reaktion meist nur dann stattfindet, wenn die Reaktionsenthalpie negativ ist. Sind Druck und Temperatur gleich, hängt der Wert der Reaktionsenthalpie nur von den Reaktionspartnern und ihren Konzentrationen ab. Sind Druck und Temperatur zu niedrig, im lebenden System sind diese sehr eingegrenzt, benötigt eine Reaktion zum Starten einen Katalysator, der das Erreichen des Übergangszustandes ermöglicht: ein Enzym. Ein Enzym hat nur Einfluß auf die Kinetik (Geschwindigkeit) einer Reaktion, thermodynamisch unmögliche Reaktionen kann es jedoch auch nicht anregen. Im Jahre 1913 beschrieben Leonor Michaelis und Maud Menten das Modell der enzymatisch katalysierten Reaktion: Enzym (E) und Substrat (S) werden in ihrer Reaktion von einer Geschwindigkeitskonstanten beeinflußt und bilden einen Enzym-Substrat-Komplex, der wieder zu E und S zerfallen kann oder über eine weitere Geschwindigkeitskonstante zu Enzym und Produkt (P) reagieren kann. Diese Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der Substratkonzentration: Die Geschwindigkeit der Reaktion ist die Maximalgeschwindigkeit dividiert durch die Summe der Substratkonzentration und der Michaelis-Menten-Konstanten. Letztgenannte ist die Substratkonzentration, bei halber Reaktionsgeschwindigkeit. Bei geringer Substratkonzentration ist die Reationsgeschwindigkeit proportional zur Substratkonzentration, je mehr Substrat dann jedoch vorhanden ist, desto langsamer wird die Reaktion, bis sie eine Maximalgeschwindigkeit erreicht, beider das Enzym eben substratgesättigt ist. Ist die Geschwindigkeitskonstante Enzym und Produkt zu Enzym-Substrat-Komplex sehr viel kleiner als vom Komplex zurück zu den Edukten, so ist die M.-M.-Konstante ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat (kleine KM, größere Affinität). Unter folgenden Voraussetzungen wird die in Rede stehende Kinetik gut beschrieben: S-Konzentration ist größer als E-Konz., am meisten liegt E.-S.-Komplex vor Enzym und Produkt reagieren kaum zum Komplex zurück Bildungsgeschwindigkeit ist fast Zerfallsgeschweindigkeit des Komplexes und sehr langsam ist der Zerfall des Komplexes in Enzym und Produkt (geschwindigkeitsbestimmend) Grob hergeleitet ist die M.-M.-Konstante die Summe der Geschwindigkeitskonstanten Komplex reagiert zu Enzym und Produkt und Komplex reagiert zu Enzym und Substrat dividiert durch Enzym und Substrat reagiert zu Komplex. Hierinnen werden die Konzentrationen eingesetzt und man erhält Komplexkonzentration ist gleich Enzymgesamtkonzetration multipliziert mit Substratkonzentration dividiert durch die Summe der Substratkonzentration und M.-M.-Konstante, wobei diese letztgenannte ja eben die Konzentrationen Enzym mal Substrat durch Komplex ist. Wird nun die Komplexkonzentration ersetzt durch Reaktionsgeschwindigkeit dividiert durch Geschwindigkeitskonstante von Komplex zu Enzym und Produkt, so erhält man nach Umformen die Katalysegeschwindigkeit. Da die maximale Geschwindigkeit erreicht ist, wenn alle katalytischen Bindungsstellen am Enzym mit Substrat gesättigt sind, kann nun für max.V eingesetzt werden: Geschwindigkeitskonstante Komplex zu Enzym und Produkt mal Enzymgesamtkonzentration, dann ergibt sich die bekannte M.-M.-Gleichung (s. Streyer, 6. Auflage, S. 242 ff.) M.-M.-Konstante und Maximalgeschwindigkeit können experimentell bestimmt werden: Geschwindigkeit zu Substratkonzentration ergibt einen hyperbolischen Kurvenverlauf, aus dem Konstante und Maximalgeschwindigkeit computermäßig berechnet werden können. Es gibt zur Überprüfung noch weitere Auftragungsmöglichkeiten: - Lineweaver-Burk: reziproke M.-M.-Gleichung (1/V=1/max.V + M.-M.-Konstante/ Produkt max.V und Substratkonzentration), X-Achsenschnittpunkt der Geraden ist -1/KM und Y-Schnittpunkt ist 1/max.V; aufgetragen wird 1/V zu 1/S-Konz. - Eadie-Hofstee: aufgetragen V zu V/S-Konz.,Y-Schnittpunkt ist max.V und X-Schnittpunkt max.V/M.-M-Konstante, die Steigung der Geraden entspricht der negativen M.-M.-Konstante - Hanes: V/S-Konz. zu S-Konz., Y-Schnittpunkt ist M.-M.-Konstante/max.-V und X-Schnittpunkt ist negative M.-M.-Konstante. - direkte lineare Auftragung ideal: V zu -Substratkonzentration, dies ergibt dann mehrere Geraden, die sich ideal in einem Punkt im ersten Quadranten schneiden und dessen Wertepaare M.-M.-Konstante und Geschwindigkeit sind. Abweichungen von einem hyperbolischen Verlauf werden hierbei aber nicht festgestellt, hier kann nicht gesagt werden, ob M.-M.-Kinetik vorliegt oder nicht. Um einer starken Verzerrung der statistischen Fehler beim Auftragen entgegen zu wirken ist Hanes oder Eadie-Hofstee als Auftragungsmethode zu bevorzugen.
Enzyme können nun aber auch selbst beeinflußt werden, indem sie z. B. gehemmt werden:
- Kompetitive Hemmung: dem Substrat strukturell ähnliche Moleküle blockieren reversibel die Bindungsstelle zum Substrat.
- unkompetitive Hemmung: Inhibitor blockiert Enzym-Substrat-Komplex
- nicht kompetitive Hemmung: Inhibitor blockiert Enzym und E.-S.-Komplex
Beantwortung der Fragen: - wie definieren Sie einen Biokatalysator? Ein Biokatalysator ist ein Enzym bzw. Ferment, es kommt unverändert aus einer Reaktion heraus. Überwiegend handelt es sich um Proteine mit Ausnahme der katalytisch wirksamen RNA. Katalysatoren setzen die Aktivierungsenergie einer Reaktion herab, damit unter den in lebenden Zellen herrschenden Bedingungen chemische Reaktionen innerhalb „lebenserhaltender“ Zeit ablaufen können. - Was sind Coenzyme, was sind Cosubstrate? Kennen Sie noch andere Faktoren, die für die Aktivität eines Enzyms notwendig sind? Coenzyme sind komplexe organische Moleküle, nicht proteinartige Bestandteile, die vorübergehend – selten auch kovalent – an den Proteinanteil binden (Vitamine u. ä.). Cosubstrate sind Bestandteile, die sich immer wieder neu an das entsprechende Enzymprotein anlagern, umgesetzt werden und dann das Enzym wieder verlassen ( FAD, NADH etc.). Weitere Faktoren, die noch für die Aktivität eines Enzyms notwendig sind bzw. Einfluß auf das Enzym nehmen, sind z. B. die Umgebung, wie Temperatur, Vorhandensein von bsp. Metallionen, pH-Wert. Desweiteren ist für eine enzymatische Reaktion wichtig, ob das Enzym weitere Bindungsstellen besitzt, die räumlich vom aktiven Zentrum getrennt sind, an denen ein allosterischer Inhibitor (Hemmer) ansetzen kann, so daß z. B. keine Produktbildung erfolgt. Durch diesen so genannten allosterischen Effektor (positiv/negativ) wird die Konformation des Enzyms geändert, die dann ggf. eine weitere Reaktion zuläßt oder verhindert. So gibt es die kompetitive Hemmung, bei der Inhibitor und Substrat um dieselbe Bindungsstelle konkurrieren oder die nicht kompetitive, bei der der Inhibitor wie gesagt die Konformation des Enzyms derart verändert, daß Substrat nicht mehr aufgenommen werden kann. Dann gibt es noch prosthetische Gruppen, die dauerhaft mit dem Enzym verbunden sind, wie z. B. die Hämgruppen, die an das Hämoglobin gebunden sind. - Wie wirkt ein Enzym auf eine exergonische Reaktion und wie sieht das Energiediagramm einer solchen Reaktion aus? Exergonisch heißt, daß freie Energie bei einer chemischen Reaktion abgegeben wird,die Reaktionsteilnehmer bilden weniger energiereiche Produkte, ΔG ist negativ. Aufgetragene freie Energie zum Reaktionsverlauf nimmt ab. Das Enzym wirkt nicht auf die Differenz der freien Energie, es erniedrigt nur die Aktivierungsenergie. - Was beschreibt die Michaelis-Menten-Konstante? Die Michaelis-Menten-konstante beschreibt die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat, d. h. die Stärke, mit der das Substrat gebunden wird. Bei halber Maximalgeschwindigkeit der enzymgesteuerten Reaktion, entspricht die Substratkonzentration der KM . Aufgetragen Reaktionsrate zu Substratkonzentration verläuft die Reaktion mit Enzym asymptotisch zu einer Maximalgeschwindigkeit, dem Maß für die Aktivität des Enzyms. Sobald das Enzym mit Substrat gesättigt ist, flacht die Kurve nämlich ab, Sättigungskurve. - Welche Formen der Enzyminhibition kennen Sie, beschreiben Sie die Unterschiede! Inhibition heißt Hemmung. Inhibitoren für Enzyme können in der Zelle selbst vorkommen oder von außen zugeführt werden. Es gibt irreversible und reversible Hemmung, irreversible binden kovalent am Enzym und verhindern die weitere chemische Katalyse ( Diisopropylfluorophosphat, blockiert Serin im aktiven Zentrum des Trypsinenzyms ). Die reversible läßt sich in kompetitive und nicht kompetitive Hemmung unterteilen, so bindet im ersten Fall der Inhibitor im aktiven Zentrum des Enzyms nicht kovalent. Wird die Konzentration des Inhibitors herabgesetzt gibt er die Bindungsstelle wieder frei. Im zweiten Fall der nicht kompetitiven Hemmung bindet der Inhibitoran an einem anderen Bereich, nicht im aktiven Zentrum, und führt eine Konformationsänderung des Enzyms herbei, so daß ebenfalls die Geschwindigkeit der Produktbildung herabgesetzt wird. Wie kann durch allosterische Hemmung ein Stoffwechselablauf geregelt werden? Ein Stoffwechselablauf wird hauptsächlich durch Enzyme geregelt. Ein Enzym kann von inaktiver Form in aktive Form durch Konformationsänderung wechseln, so daß dann die richtige Raumstruktur gegeben ist, um das Substrat zu binden. So haben solche Enzyme zumeist ein allosterisches Zetrum, welches räumlich am aktiven Zentrum getrennt ist. Allosterische Hemmung – άλλος anders und στέρεος räumlich – bedeutet, daß das Enzym in seiner Aktivität durch seine Änderung der Konformation in eine nicht bindungsfähige Raumstruktur übergeht. Hierzu binden dann regulatorische Moleküle/allosterische Effektoren am entsprechenden Zentrum des Biokatalysators und stabilisieren seine inaktive Form. Somit wird die Katalyse, die den Stoffwechsel regelt allosterisch gehemmt. Es gibt nun noch Enzyme aus einem bzw. mehreren Polypeptiden, hierdurch erfolgt die Substratbindung im ersten Fall zuerst mit steigender Substratkonzentration stark zu und flacht dann ab, hyperbolischer Kurvenverlauf bei der Auftragung von Reaktionsrate zu Substratkonzentration. Im zweiten Fall, das Enzym hat mehrere Untereinheiten, hat die Kurve einen sigmoiden Verlauf, d. h. die Reaktionsrate ist zu beginn mit steigender Substratkonzentration relativ gering, nimmt dann jedoch empfindlich in einem bestimmten Bereich zu, sobald die Substratkonzentration sich auch nur gering ändert und läuft dann flach gegen die maximale Umsatzrate aus. Aufgrund dieser heftigen Reaktion auf geringe Sustratkonzentrationsänderung ist es für den Stoffwechselablauf wichtig, daß er allosterisch gehemmt werden kann. Warum verhindert starke Säure die Katalyse eines Enzyms? Es verhält sich so, daß die meisten enzymkatalysierten Reaktionen vom pH-Wert des umgebenden Mediums abhängen, jedes Enzym hat seinen präferierten pH-Wert, bei dem es am aktivsten ist. Die entsprechenden Gruppen: Amino-, Carboxyl- dissoziieren jeweils,indem sie z. B. in saurem Milieu H+ aufnehmen und so kann beispielsweise die Carboxylgruppe gänzlich zu -COOH dissoziieren und ist damit ungeladen und nicht mehr mit anderen Gruppen des Proteins in Wechselwirkung treten. Somit kann die Konformation des Enzyms derart gestört werden, daß es nicht mehr mit seinem Substrat binden kann.
b) Herausarbeiten der Fragestellung:
Wie weit oben ausgeführt, ist die Acetylcholinesterase ein Enzym, welches im synaptischen Spalt und der motorischen Endplatte Acetylcholin hydrolisiert. Acetylcholin wirkt als Neurotransmitter. Aus den Schwanzmuskeln des Flußkrebses kann es gewonnen werden, dabei ist es interessant zu erfahren, ob es vermehrt an der motorischen Endplatte gebunden ist (Extraktionsverwertung des Pellets), oder auch im synaptischen Spalt (Messung des Überstandes) nachgewiesen werden kann, gibt es bereits Literaturwerte dazu und wie ist der Wirkmechanismus?
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posted by rockitgirl May 19 2009, 7:20 AM EDT
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