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Exkretion

wendtoni — Mon, 25 May 2009 02:58:06 CDT

Tierphysiologisches Praktikum

Protokoll: Exkretion und Nierenfunktion

von Julia Krüger Toni Wendt Ines Welzel

Kurs Freitag zum 29.05.2009

Einleitung
Stickstoffhaltige Verbindungen, die nicht mehr verwertbar sind, sind oft toxisch und müssen aus dem Organismus entfernt werden: über Exkretion. Die Exkretion ist auch ein Vorgang der Ionen- und Osmolytregulation.
Wichtige Abbauprodukte der Proteine/Nucleinsäuren sind:

Ammoniak, wasserlöslich und damit ein Zellgift. Bei den aquatischen Invertebraten, aquatischen Insektenlarven, Fischen oder Amphibienlarven ist es weit verbreitet. ( Asseln und Schaben können jedoch ebenfalls Ammoniak abgeben ) Die Abgabe wird über die Haut oder Kiemen bewerkstelligt ( ammoniotelische Tiere )
Harnsäure, schlecht wasserlöslich, daher relativ ungiftig. Das Ausscheidungsprodukt ist eine Paste, da die Harnsäure auskristallisiert ist. Vögel, Insekten und Reptilien scheiden so aus. (uricotelische Tiere ) Wird Harnsäure bei Wirbeltieren gebildet, so wird sie dann in Gelenken oder Gewebe eingelagert ( Gicht ).
Harnstoff, wasserlöslich, geringer toxisch als Ammoniak. Da Harnstoff nur gelöst ausgeschieden wird und osmotische Eigenschaften hat, ist er in den Wasserhaushalt eingebunden.. Harnstoff kommt bei Landwirbeltieren (einschließlich Säugetiere), Amphibien, Schildkröten und Knorpelfischen vor: ureotelische Tiere.

Bei den Säugetieren ist die Niere das Exkretionsorgan. Sie reguliert Wasser- und Elektrolythaushalt und dient eben der Ausscheidung von Stoffwechselwechselprodukten, sowie wasserlöslichen Fremdsubstanzen, sie reguliert den Säure- Basen- Haushalt, die Kalziumresorption, den Blutdruckes und ist auch an der Blutbildung beteiligt. Die Niere wird von der Faserkapsel umschlossen, darnach folgt nach innen die ca. 5 bis 8 mm dicke Nierenrinde. Diese enthält die Malphighi-Körperchen sowie die proximalen und distalen Tubulae. Unter der Nierenrinde befindet sich das Nierenmark, in ihm die Henle-Schleifen. Das Mark ist in 15 bis 20 Pyramiden organisiert. In der Vertiefung der Nieren liegt das Nierenbecken, das den Harnleiter ausführt. Der Nierenkelch sitzt zwischen Mark und Nierenbecken und die Spitzen der Markpyramiden ragen in den Kelch ein.
Das Nephron ist die funktionelle Einheit der Niere. Es besteht aus dem Malphighi- Körperchen, das aus der Bowman-Kapsel und den innen liegenden Kapillaren, den Glomerulae, zusammengesetzt ist. Die Podocyen fungieren als eine Art Sieb im Malphighi- Körperchen. Durch den hohen Kapillardruck entsteht eine Ultrafiltration, die den Primärharn bildet. Die Podocyten lassen nur „Teilchen“ durch, die kleiner als 50 nm sind, d. h. es werden Proteine und Moleküle zurückgehalten, die größer als 70 kDa sind. Daraus folgt, daß das Ultrafiltrat des Blutplasmas proteinfrei ist. Zusätzlich wird der Filtrationsdruck durch den geringeren Durchmesser der abführenden Arteriolen im Gegensatz zum Durchmesser der zuführenden Atriolen verstärkt. Der Menschen bildet ca.pro Tag 180l Primärharn, der in den proximalen Tubulus gelangt und von dort durch den absteigenden Ast in die Henle-Schleife, von dort aus über den aufsteigenden Ast zum distalen Tubulus und schließlich ins Sammelrohr. Der Bereich zwischen den Schlaufen wird als Interstitium bezeichnet. Im Tubulussystem liegt ein osmotischer Gradient vor, so daß der Großteil des Wassers, Glucose und Aminosäuren aktiv wieder zurück in das Blut transportiert werden müssen. Im aufsteigenden Ast und der Henle-Schleife wird Na+ und Cl- aktiv zurückgewonnen, für Wasser ist die Henle-Schleife undurchlässig. Erst wieder im absteigenden Ast kann Wasser resorbiert werden. Zusammengenommen entsteht dadurch auch längs der Schleife ein osmotischer Gradient auf, der bewirkt, daß auch im Sammelrohr dem Harn weiter Wasser entzogen werden kann. Es werden aus den 180 l Primärharn nur 1,5 bis 2 l Endharn gebildet. Der Endharn ist das, was letztendlich ausgeschieden wird. Die Rückgewinnung des Wassers und der Ionen geschieht also im Gegenstromprinzip. Dadurch, daß die Na-Ionen aktiv im aufsteigenden Ast der Henle-Schleife vom Primärharn in das Interstitium transportiert werden, wird der Harn hypoton und das Interstitium dann hyperton. Wasser gelangt vom absteigenden Ast passiv in das Interstitium, weil dessen Wand wasserdurchlässig ist, somit wird der Harn konzentriert. Die Wasserrückgewinnung ist damit passiv an die Natriumrückresorption gekoppelt. Der Harn besteht hauptsächlich aus Wasser, gelöstem Harnstoff und wasserlöslichen Abfallprodukten.
Renin steuert die Zusammensetzung des Harns, es wandelt Angiotensinogen in Angitensin I um, das in Angiotensin II weiter umgewandelt wird, dieses ist Gefäß verengend und setzt Aldosteron ( Na-Resorption ) und das Antidiuretische Hormon frei. Durch die engeren Gefäße steigt der Filtrationsdruck. Diese Kaskade bezeichnet man als Renin-Angiotensin-System.
Ist eine Flüssigkeit hoch osmotisch konzentriert, sinkt der Gefrierpunkt (Gefrierpunktserniedrigung). Dieses Prinzip beruht auf der Störung im Aufbau des Gitters beim Einfrieren, da die Wassermoleküle durch das Vorhandensein von mehr Fremdmolekülen oder Ionen in ihrer Anordnung gestört werden. Osmotischer Druck bedeutet den Ausgleich zweier verschiedener Drücke in einem System, die durch eine semipermeable Membran getrennt werden. Durch den Druck wird Wasser von einer verdünnteren Lösung in die höher konzentrierte Lösung „gezogen“.
100 mmol/l Harnstoff haben 300 mosmol/l durch drei osmotische Teilchen pro Harnstoffmolekül, 100 mmol/l NaCl haben 200 mosmol/l durch 2 osmotische Teilchen und 100 mmol/l CaCl2 haben 300 mosmol/l.
Beispiele von Ausscheidungsorganen einiger Tiere: Kängururatte: Wüstenbewohner, Säugetier mit paarigen Nieren. Die Nieren dieser Tiere besitzen eine extrem lange Henle-Schleife um die Wasserrückresorption zu maximieren. Der Wasserbedarf wird durch Stoffwechselwasser (90%) und durch die Nahrung gedeckt, den Verlust von Atmungsfeuchtigkeit wird durch Kondensation des Wassers in den Nasenwegen vermieden. Dadurch muss dieses Tier kein Wasser trinken . Meeresfische: Diese müssen Meerwasser trinken, um den Wasserverlust auszugleichen. Durch Osmose verlieren sie Wasser an die Umgebung. Natrium- und Chloridionen werden durch das Blut über die Kiemen aus Salzausscheidungszellen abgegeben. Meeresfische sind hypoosmotische Regulatoren. Sie besitzen eine ursprüngliche Niere, Ophistonephros, welche Magnesiumsulfat, Harnstoff und ein wenig Wasser ausscheidet. Süßwasserfische: brauchen kein Wasser zu trinken, NaCl wird über die Kiemen aufgenommen und das Wasser strömt einfach osmotisch nach. Natrium- und Chloridionen müssen aber widerum aktiv im Tubulus rückresorbiert werden. Süßwasserfische scheiden verdünnten Harn aus. Das Blut ist hyperosmotisch.
Regenwurm: Der Regenwurm besitzt 1 paar Metanephridien pro Segment. Als terrestrischer Oligochaet scheidet er Harnstoff bzw. Ammoniak, je nach Umweltbedingungen, über die Metanephridien aus. Die Nephridien gehören zur Osmoregulation. Flußkrebs: Als Exkretionsorgane dienen tubulär strukturierte Drüsen die paarig vorhanden sind. Es handelt sich um Antennal- oder Maxillardrüsen, da sie an der Basis der Maxillen, bzw. Antennen sitzen.
Insekten: Die Exkretionsorgane sind Malpighi´sche Gefäße, sie entspringen dem Knotenpunkt von Mittel- und Enddarm. Es sind Blindschläuche, die in den Körper hinein ragen und im Hämocoel enden. Die Ausscheidung erfolgt über aktive Sezernierung von Kaliumionen. Ddurch die ausgeschiedenen Ionen wird Wasser nachgezogen. Die Harnsäure tritt als Kaliumharnsäure in die Gefäße ein, das Kalium wird rückresorbiert und die Harnsäure wird über den Fäzes ausgeschieden.
Quellen: Folien Vorlesung Tierphysiologie Zoologie, Hickman, Roberts, et al, Pearson Studium, 13 Auflage Zoologie, Wehner, Gering, Thieme Verlag 24. Auflage Allgemeine Zoologie, Hynek Burda, UTB basics

Messung 1
Erwartungen
Im ersten Versuch soll die zeitliche Volumenausscheidung und die Abgabe von Osmolyten geprüft werden. Die Bestimmung der Osmolytkonzentration erfolgt hierbei über die Gefrierpunktserniedrigung mit Hilfe eines Osmometers. Betreffend des Urinvolumens wird bei den Probanden eine Abnahme zu sehen sein. Diese wird bei den Durstern zuerst recht stark sein und dann immer schwächer werden, da sie schon zuvor durch die Dehydrierung ein geringes Urinvolumen hatten. Bei den Trinkern wird die Abnahme kontinuierlicher sein. DieTrinker haben schon durch die starke Flüssigkeitsaufnahme einen verdünnten Urin, so wird die Osmolytkonzentration niedriger sein als die bei den Durstern, bei denen eine hohe osmotische Konzentration anzunehmen ist. Aus Urinvolumen und Osmolytkonzentration kann die Menge an Osmolyten berechnet werden. Da die Versuchspersonen zu Beginn des Versuchs längere Zeit keinen Urin ausgeschieden haben, wird die Osmolytmenge besonders in der ersten Urinprobe sehr hoch sein. Da die Niere über die Zeit kontinuierlich weiterarbeitet und die Probanden in regelmäßigen Abständen urinieren, sollte die Menge osmotisch wirksamer Teilchen im weiteren Versuchsverlauf relativ konstant bleiben. Es wird angenommen , daß Urinvolumen und Osmolytmenge sinken, ist eine annähernde Konstanz der osmotischen Konzentration zu erwarten.

Versuchsdurchführung
siehe Skript Seite 2-3, abweichend wurden als Durster eben Durster und Suppenesser, Trinker: Bier und Wasser eingeteilt.

Ergebnisse Ersichtlich ist, daß die Trinker mehr Urin ausscheiden als die Durster. Beide Gruppen weisen jedoch insgeesamt eine Verringerung des Urinvolumen auf. Die Abnahme ist bei beiden zu Beginn am stärksten. Die Durster haben eine fast konstante Urinvolumenabnahme, die Trinker eine kontinuierliche. Desweiteren ist erkennbar, daß die Osmolytkonzentration der Durster deutlich über denen der Trinker liegen. Mit geringen Abweichungen sind die Konzentrationen der osmotisch wirksamen Teilchen bei beiden Gruppen über die Zeit in etwa gleich. Wobei es die Trinker in den letzen Urinproben einen Konzentrationsanstieg zu verzeichnen haben Ferner ist zu bemerken, daß die Menge an osmotisch wirksamen Teilchen zu Beginn sehr hoch ist. Bei den Durstern höher als bei denn Trinker.
Messung 2
Erwartungen
Hier wird die Harnstoffausscheidung gemessen. Durch die Spaltung von Harnstoff durch Enzyme entstehen Ammoniak und Kohlendioxid. Mit Hilfe des Coenzyms NADH oder NADPH kann Ammoniak mit α-Ketoglutarat zu L-Glutamat reagieren. Der Verbrauch an NAD(P)H kann photometrisch gemessen werden. Dabei entsprechen 2 NAD(P)H-Moleküle einem Harnstoffmolekül. Da Harnstoff osmotisch wirksam ist, wird seine Konzentration wie im ersten Versuch bei der Osmolytkonzentration bei beiden Gruppen in etwa konstant bleiben, allerdings den Durstern deutlich höher. Die Harnstoffmenge jedoch müßte während des Versuchs abnehmen, weil durch das Urinieren dauernd Harnstoff abgegeben wird und wieder neu synthetisiert werden muß

Versuchsdurchführung
siehe Skript Seite 3-5
Beispielrechnung für Probe D0;1 & D0;2: ΔEProbe = E0(Probe) - E1(Probe) ΔELeerwert = E0(Leerwert) - E1(Leerwert) ΔEgesamt = ΔEProbe - ΔELeerwert
Betr. Harnstoffkonzentration: Es ist festzustellen, daß die Harnstoffkonzentration der Durster fast viermal so hoch ist wie die der Trinker. Außerdem bleibt bei den Durstern die Konzentration des Harnstoffs gleich. Bei den Trinkern ist die Konzentration abnehmend, dann steigend bis zum Doppelten der Konzentration von der ersten Probe.
Veränderung der Harnstoffmenge: Hier wird deutlch, daß zu Anfang die Harnstoffmenge bei beiden Gruppen hoch ist, bei den Trinkern geringer. Bei beiden Gruppen wird die größte Harnstoffmenge gleich zu Beginn ausgeschieden. Dann bleibt die Menge relativ gleich, bei den Trinkern höher als den Durstern.
Messung 3
Erwartungen
Der dritte Versuch soll die Chloridionenausscheidung bestimmen. Als Nachweis wird die Ausfällung von Chloridionen durch Silberionen verwendet. Chromationen dienen als Indikator, sie sind zuerst gelb, dann erfolgt die Reaktion mit den Silberionen zu einem roten Farbumschlag, dem Silberchromat, was sofort wieder zerfällt. Wenn alle Chloridionen als schwerlösliches Silberchlorid vorliegen, bleibt das rote Silberchromat stabil. So kann über den Verbrauch an Silbernitratlösung die Chloridionenkonzentration berechnet werden. Chloridionen sind osmotisch wirksame Teilchen. So ist zu erwarten, daß deren Konzentration wie beim Harnstoff konstant bleibt. Die Trinker sollten dabei jedoch eine niedrigere Konzentration aufweisen. Weil ständig Chloridionen beim Urinieren ausgeschieden werden, wird die Menge abnehmen.

Versuchsdurchführung
siehe Skript Seite 5-6

Ergebnisse

Eichgerade
Mit Hilfe der Eichgerade werden die Chloridionenkonzentrationen der jeweiligen Urinproben ermittelt.

Veränderung der Chloridionenkonzentration
Die Konzentration der Chloridionen bei den Durstern ist deutlich höher ist als bei den Trinkern. Bei beiden Gruppen ist sie fast konstant. Wobei sie die Durster zuerst sehr hohe Werte haben, dann eine deutliche Abnahme erfolgt und schließlich schwankend ist.

Veränderung der Chloridionenmenge
Die Chloridmenge in der ersten Probe ist recht hoch. Bei den Durstern doppelt so stark wie bei den Trinkern. Darauf haben dann beide Gruppen eine starke Mengenabnahme. Die weiteren Proben zeigen eine konstante Chloridausscheidung.

Diskussion
Im Ganzen ist zu bemerken, daß die Erwartungen bei allen drei Messungen erfüllt wurden. Das Urinvolumen hat wie vor allem nach der ersten Probe abgenommen, da die Probanden vor dem Versuch längere Zeit nicht uriniert hatten, war es bei Durstern und Trinkern hoch und weil zwischenzeitlich keine weitere Flüssigkeit aufgenommen wurde, wurde das abgegebene Volumen geringer. Zum Schluß wird klar, daß auch die Trinker ihren Wasserhaushalt regulieren müssen, um ihn entsprechend zu halten. Die Menge an Osmolyten hat genauso von der ersten zur weiteren Probe stark abgenommen und zeigt dann einen schwachen, aber bemerkbaren Abfall. Da Harnstoff und Chlorid osmotisch wirksame Teilchen sind, sind die gleichen Ergebnisse wie bei der Osmolytmenge festzustellen. Bemerkenswert ist, daß die Trinker bereits ab der zweiten Messung in allen weiteren Fällen eine höhere Menge haben als die Durster. Dies liegt offensichtlich daran, daß die Durster mit der ersten Urinprobe das größte Volumen und dabei die größte Menge osmotisch wirksamer Teilchen ausschieden und dann nur noch sehr wenig Volumen abgeben konnten. Die Trinker hatten im gesamten Versuch weitaus mehr Volumen. Da sie mehr Flüssigkeit ausschieden, hatten sie auch einen höheren Osmolyt-, Harnstoff- und Chloridverlust. Sowohl bei Osmolytkonzentration, Harnstoff- wie auch Chlorid-, konnte eine relative Konstanz festgestellt werden. Eindeutig, war dies bei den Durstern festzustellen. Die Variationen sind ganz sicher damit zu erklären, daß über die Zeit nicht immer genau dieselbe Menge an osmotisch wirksamen Teilchen vorhanden ist. Bei den Trinkern waren die Konzentrationen immer geringer als bei den Durstern, da die Teilchen durch die Vorhydrierung stärker verdünnt waren.

Enzymkinetik

wendtoni — Mon, 18 May 2009 02:53:23 CDT

Protokoll zum 3. Versuchstag
Lehrveranstalter Prof. Dr. Achazi Durchführung Freitag, 15.05.2009, Kurs B Thema Enzymkinetik Protokollführung Julia Krüger, Toni Wendt, Ines Welzel

Einleitung:

a) theoretischer Hintergrund/Beantwortung der Fragen
Einleitung zur Enzymkinetik Zum Thema Enzymkinetik besteht die Möglichkeit dies anhand eines Neurotransmitters, der aus den großen Muskeln eines Krebses gewonnen werden kann, zu untersuchen. Durch Homogenisieren und Abzentrifugieren von Überstand und Pellet kann aus den Muskeln Acetylcholinesterase gewonnen werden. Es ist die Grundaktivität mittels Verdünnungsreihen zu bestimmen und schließlich im Photometer die Enzymkinetik der Acetylcholinesterase zu bestimmen.
Die Acetylcholinesterase ist ein Biokatalysator, der Acetylcholin zu Essigsäure und Cholin hydrolisiert. Das Acetylcholin ist ein Neurotransmtter, der an der neuromuskulären Endplatte gebunden ist und frei im synaptischen Spalt zur Reaktion mit cholinergenen Synapsen vorkommt. Acetylcholin bewirkt an nicotinischen Acetylcholinrezeptoren einen Einstrom von Natrium und einen Ausstrom von Kalium an der postsynaptischen Membran, so daß ein Aktionspotential (nach Depolarisation) die Kontraktion der Muskelfaser bewirken kann. Wird das Acetylcholin nicht durch die seine Esterase abgebaut, kommt es zum „Dauertremor“, d. h. die Natrium- und Kaliumkanäle bleiben aktiv und die Depolarisation der Membran geht nicht mehr zurück, somit kommt es zur Muskelschwäche und vorzeitigem Exitus.
Hinsichtlich der Enzymkinetik kann ausgeführt werden, daß eine chemische Reaktion meist nur dann stattfindet, wenn die Reaktionsenthalpie negativ ist. Sind Druck und Temperatur gleich, hängt der Wert der Reaktionsenthalpie nur von den Reaktionspartnern und ihren Konzentrationen ab. Sind Druck und Temperatur zu niedrig, im lebenden System sind diese sehr eingegrenzt, benötigt eine Reaktion zum Starten einen Katalysator, der das Erreichen des Übergangszustandes ermöglicht: ein Enzym. Ein Enzym hat nur Einfluß auf die Kinetik (Geschwindigkeit) einer Reaktion, thermodynamisch unmögliche Reaktionen kann es jedoch auch nicht anregen. Im Jahre 1913 beschrieben Leonor Michaelis und Maud Menten das Modell der enzymatisch katalysierten Reaktion: Enzym (E) und Substrat (S) werden in ihrer Reaktion von einer Geschwindigkeitskonstanten beeinflußt und bilden einen Enzym-Substrat-Komplex, der wieder zu E und S zerfallen kann oder über eine weitere Geschwindigkeitskonstante zu Enzym und Produkt (P) reagieren kann. Diese Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der Substratkonzentration: Die Geschwindigkeit der Reaktion ist die Maximalgeschwindigkeit dividiert durch die Summe der Substratkonzentration und der Michaelis-Menten-Konstanten. Letztgenannte ist die Substratkonzentration, bei halber Reaktionsgeschwindigkeit. Bei geringer Substratkonzentration ist die Reationsgeschwindigkeit proportional zur Substratkonzentration, je mehr Substrat dann jedoch vorhanden ist, desto langsamer wird die Reaktion, bis sie eine Maximalgeschwindigkeit erreicht, beider das Enzym eben substratgesättigt ist. Ist die Geschwindigkeitskonstante Enzym und Produkt zu Enzym-Substrat-Komplex sehr viel kleiner als vom Komplex zurück zu den Edukten, so ist die M.-M.-Konstante ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat (kleine KM, größere Affinität). Unter folgenden Voraussetzungen wird die in Rede stehende Kinetik gut beschrieben: S-Konzentration ist größer als E-Konz., am meisten liegt E.-S.-Komplex vor Enzym und Produkt reagieren kaum zum Komplex zurück Bildungsgeschwindigkeit ist fast Zerfallsgeschweindigkeit des Komplexes und sehr langsam ist der Zerfall des Komplexes in Enzym und Produkt (geschwindigkeitsbestimmend) Grob hergeleitet ist die M.-M.-Konstante die Summe der Geschwindigkeitskonstanten Komplex reagiert zu Enzym und Produkt und Komplex reagiert zu Enzym und Substrat dividiert durch Enzym und Substrat reagiert zu Komplex. Hierinnen werden die Konzentrationen eingesetzt und man erhält Komplexkonzentration ist gleich Enzymgesamtkonzetration multipliziert mit Substratkonzentration dividiert durch die Summe der Substratkonzentration und M.-M.-Konstante, wobei diese letztgenannte ja eben die Konzentrationen Enzym mal Substrat durch Komplex ist. Wird nun die Komplexkonzentration ersetzt durch Reaktionsgeschwindigkeit dividiert durch Geschwindigkeitskonstante von Komplex zu Enzym und Produkt, so erhält man nach Umformen die Katalysegeschwindigkeit. Da die maximale Geschwindigkeit erreicht ist, wenn alle katalytischen Bindungsstellen am Enzym mit Substrat gesättigt sind, kann nun für max.V eingesetzt werden: Geschwindigkeitskonstante Komplex zu Enzym und Produkt mal Enzymgesamtkonzentration, dann ergibt sich die bekannte M.-M.-Gleichung (s. Streyer, 6. Auflage, S. 242 ff.) M.-M.-Konstante und Maximalgeschwindigkeit können experimentell bestimmt werden: Geschwindigkeit zu Substratkonzentration ergibt einen hyperbolischen Kurvenverlauf, aus dem Konstante und Maximalgeschwindigkeit computermäßig berechnet werden können. Es gibt zur Überprüfung noch weitere Auftragungsmöglichkeiten: - Lineweaver-Burk: reziproke M.-M.-Gleichung (1/V=1/max.V + M.-M.-Konstante/ Produkt max.V und Substratkonzentration), X-Achsenschnittpunkt der Geraden ist -1/KM und Y-Schnittpunkt ist 1/max.V; aufgetragen wird 1/V zu 1/S-Konz. - Eadie-Hofstee: aufgetragen V zu V/S-Konz.,Y-Schnittpunkt ist max.V und X-Schnittpunkt max.V/M.-M-Konstante, die Steigung der Geraden entspricht der negativen M.-M.-Konstante - Hanes: V/S-Konz. zu S-Konz., Y-Schnittpunkt ist M.-M.-Konstante/max.-V und X-Schnittpunkt ist negative M.-M.-Konstante. - direkte lineare Auftragung ideal: V zu -Substratkonzentration, dies ergibt dann mehrere Geraden, die sich ideal in einem Punkt im ersten Quadranten schneiden und dessen Wertepaare M.-M.-Konstante und Geschwindigkeit sind. Abweichungen von einem hyperbolischen Verlauf werden hierbei aber nicht festgestellt, hier kann nicht gesagt werden, ob M.-M.-Kinetik vorliegt oder nicht. Um einer starken Verzerrung der statistischen Fehler beim Auftragen entgegen zu wirken ist Hanes oder Eadie-Hofstee als Auftragungsmethode zu bevorzugen.
Enzyme können nun aber auch selbst beeinflußt werden, indem sie z. B. gehemmt werden:

Kompetitive Hemmung: dem Substrat strukturell ähnliche Moleküle blockieren reversibel die Bindungsstelle zum Substrat.
unkompetitive Hemmung: Inhibitor blockiert Enzym-Substrat-Komplex
nicht kompetitive Hemmung: Inhibitor blockiert Enzym und E.-S.-Komplex

Beantwortung der Fragen: - wie definieren Sie einen Biokatalysator? Ein Biokatalysator ist ein Enzym bzw. Ferment, es kommt unverändert aus einer Reaktion heraus. Überwiegend handelt es sich um Proteine mit Ausnahme der katalytisch wirksamen RNA. Katalysatoren setzen die Aktivierungsenergie einer Reaktion herab, damit unter den in lebenden Zellen herrschenden Bedingungen chemische Reaktionen innerhalb „lebenserhaltender“ Zeit ablaufen können. - Was sind Coenzyme, was sind Cosubstrate? Kennen Sie noch andere Faktoren, die für die Aktivität eines Enzyms notwendig sind? Coenzyme sind komplexe organische Moleküle, nicht proteinartige Bestandteile, die vorübergehend – selten auch kovalent – an den Proteinanteil binden (Vitamine u. ä.). Cosubstrate sind Bestandteile, die sich immer wieder neu an das entsprechende Enzymprotein anlagern, umgesetzt werden und dann das Enzym wieder verlassen ( FAD, NADH etc.). Weitere Faktoren, die noch für die Aktivität eines Enzyms notwendig sind bzw. Einfluß auf das Enzym nehmen, sind z. B. die Umgebung, wie Temperatur, Vorhandensein von bsp. Metallionen, pH-Wert. Desweiteren ist für eine enzymatische Reaktion wichtig, ob das Enzym weitere Bindungsstellen besitzt, die räumlich vom aktiven Zentrum getrennt sind, an denen ein allosterischer Inhibitor (Hemmer) ansetzen kann, so daß z. B. keine Produktbildung erfolgt. Durch diesen so genannten allosterischen Effektor (positiv/negativ) wird die Konformation des Enzyms geändert, die dann ggf. eine weitere Reaktion zuläßt oder verhindert. So gibt es die kompetitive Hemmung, bei der Inhibitor und Substrat um dieselbe Bindungsstelle konkurrieren oder die nicht kompetitive, bei der der Inhibitor wie gesagt die Konformation des Enzyms derart verändert, daß Substrat nicht mehr aufgenommen werden kann. Dann gibt es noch prosthetische Gruppen, die dauerhaft mit dem Enzym verbunden sind, wie z. B. die Hämgruppen, die an das Hämoglobin gebunden sind. - Wie wirkt ein Enzym auf eine exergonische Reaktion und wie sieht das Energiediagramm einer solchen Reaktion aus? Exergonisch heißt, daß freie Energie bei einer chemischen Reaktion abgegeben wird,die Reaktionsteilnehmer bilden weniger energiereiche Produkte, ΔG ist negativ. Aufgetragene freie Energie zum Reaktionsverlauf nimmt ab. Das Enzym wirkt nicht auf die Differenz der freien Energie, es erniedrigt nur die Aktivierungsenergie. - Was beschreibt die Michaelis-Menten-Konstante? Die Michaelis-Menten-konstante beschreibt die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat, d. h. die Stärke, mit der das Substrat gebunden wird. Bei halber Maximalgeschwindigkeit der enzymgesteuerten Reaktion, entspricht die Substratkonzentration der KM . Aufgetragen Reaktionsrate zu Substratkonzentration verläuft die Reaktion mit Enzym asymptotisch zu einer Maximalgeschwindigkeit, dem Maß für die Aktivität des Enzyms. Sobald das Enzym mit Substrat gesättigt ist, flacht die Kurve nämlich ab, Sättigungskurve. - Welche Formen der Enzyminhibition kennen Sie, beschreiben Sie die Unterschiede! Inhibition heißt Hemmung. Inhibitoren für Enzyme können in der Zelle selbst vorkommen oder von außen zugeführt werden. Es gibt irreversible und reversible Hemmung, irreversible binden kovalent am Enzym und verhindern die weitere chemische Katalyse ( Diisopropylfluorophosphat, blockiert Serin im aktiven Zentrum des Trypsinenzyms ). Die reversible läßt sich in kompetitive und nicht kompetitive Hemmung unterteilen, so bindet im ersten Fall der Inhibitor im aktiven Zentrum des Enzyms nicht kovalent. Wird die Konzentration des Inhibitors herabgesetzt gibt er die Bindungsstelle wieder frei. Im zweiten Fall der nicht kompetitiven Hemmung bindet der Inhibitoran an einem anderen Bereich, nicht im aktiven Zentrum, und führt eine Konformationsänderung des Enzyms herbei, so daß ebenfalls die Geschwindigkeit der Produktbildung herabgesetzt wird. Wie kann durch allosterische Hemmung ein Stoffwechselablauf geregelt werden? Ein Stoffwechselablauf wird hauptsächlich durch Enzyme geregelt. Ein Enzym kann von inaktiver Form in aktive Form durch Konformationsänderung wechseln, so daß dann die richtige Raumstruktur gegeben ist, um das Substrat zu binden. So haben solche Enzyme zumeist ein allosterisches Zetrum, welches räumlich am aktiven Zentrum getrennt ist. Allosterische Hemmung – άλλος anders und στέρεος räumlich – bedeutet, daß das Enzym in seiner Aktivität durch seine Änderung der Konformation in eine nicht bindungsfähige Raumstruktur übergeht. Hierzu binden dann regulatorische Moleküle/allosterische Effektoren am entsprechenden Zentrum des Biokatalysators und stabilisieren seine inaktive Form. Somit wird die Katalyse, die den Stoffwechsel regelt allosterisch gehemmt. Es gibt nun noch Enzyme aus einem bzw. mehreren Polypeptiden, hierdurch erfolgt die Substratbindung im ersten Fall zuerst mit steigender Substratkonzentration stark zu und flacht dann ab, hyperbolischer Kurvenverlauf bei der Auftragung von Reaktionsrate zu Substratkonzentration. Im zweiten Fall, das Enzym hat mehrere Untereinheiten, hat die Kurve einen sigmoiden Verlauf, d. h. die Reaktionsrate ist zu beginn mit steigender Substratkonzentration relativ gering, nimmt dann jedoch empfindlich in einem bestimmten Bereich zu, sobald die Substratkonzentration sich auch nur gering ändert und läuft dann flach gegen die maximale Umsatzrate aus. Aufgrund dieser heftigen Reaktion auf geringe Sustratkonzentrationsänderung ist es für den Stoffwechselablauf wichtig, daß er allosterisch gehemmt werden kann. Warum verhindert starke Säure die Katalyse eines Enzyms? Es verhält sich so, daß die meisten enzymkatalysierten Reaktionen vom pH-Wert des umgebenden Mediums abhängen, jedes Enzym hat seinen präferierten pH-Wert, bei dem es am aktivsten ist. Die entsprechenden Gruppen: Amino-, Carboxyl- dissoziieren jeweils,indem sie z. B. in saurem Milieu H+ aufnehmen und so kann beispielsweise die Carboxylgruppe gänzlich zu -COOH dissoziieren und ist damit ungeladen und nicht mehr mit anderen Gruppen des Proteins in Wechselwirkung treten. Somit kann die Konformation des Enzyms derart gestört werden, daß es nicht mehr mit seinem Substrat binden kann.
b) Herausarbeiten der Fragestellung:
Wie weit oben ausgeführt, ist die Acetylcholinesterase ein Enzym, welches im synaptischen Spalt und der motorischen Endplatte Acetylcholin hydrolisiert. Acetylcholin wirkt als Neurotransmitter. Aus den Schwanzmuskeln des Flußkrebses kann es gewonnen werden, dabei ist es interessant zu erfahren, ob es vermehrt an der motorischen Endplatte gebunden ist (Extraktionsverwertung des Pellets), oder auch im synaptischen Spalt (Messung des Überstandes) nachgewiesen werden kann, gibt es bereits Literaturwerte dazu und wie ist der Wirkmechanismus?

Protokoll - Atmung

wendtoni — Wed, 13 May 2009 09:14:40 CDT

Inhaltsverzeichnis

Einleitung.........................................................................................................3
- Hämoglobin...................................................................................................3
- poikilotherme / homoiotherme Tiere.............................................................4

Material und Methoden....................................................................................
- Versuch 1........................................................................................................
- Versuch 2.........................................................................................................
- Versuch 3...........................................................................................................

Durchführung
- Versuch 1...............................................................................................................
- Versuch 2 …......................................................................................................
- Versuch 3..............................................................................................................

Ergebnisse
- Versuch 1............................................................................................................
- Versuch 2.............................................................................................................
- Versuch 3............................................................................................................

Auswertung und Diskussion
- Versuch 1...........................................................................................................
- Versuch 2..........................................................................................................
- Versuch 3............................................................................................................

Einleitung

An diesem Versuchstag ging es um das Thema Sauerstofftransport und Atmung.
Es existieren zwei verschiedene Formen der Atmung. Die innere Atmung oder auch Zellatmung genannt und die äußere Atmung. Unter äußerer Atmung versteht man die an der Sauerstofftaufnahme und Kohlendioxidabgabe verbundenen Vorgänge. Dagegen handelt es sich um eine innere Atmung, wenn durch Oxidation chemischer Verbindungen Energie gewonnen wird.
Der Weg des Sauerstoffs aus der Umgebung bis zu den aufnehmenden Zellen umfasst mehrere Teilschritte, die nur kurz erläutert werden.
Als erstes wird der Sauerstoff bis zu den respiratorischen Epithelien, möglischst ganz nah, durch Konvektion transportiert. Diesen Vorgang nennt man Ventilation.
Im nächsten Schritt wird durch Diffusion der Übertritt des Sauerstoffs in die Erythrocyten ermöglicht. Es handelt sich um einen externen Gasaustausch.
Anschließend erfolgt der Transport mit dem Blut bis an die Verbraucherzellen durch Konvektion. Dieser Vorgang wird als Perfusion bezeichnet.
Zum Schluss kommt es zum Übertritt des Sauerstoffs aus den Erythrocyten bis in die atmende Zelle, auch wieder mithilfe der Diffusion. Der Begriff interner Gasaustausch wird hierzu verwendet.

Die Sauerstoffmenge im arteriellen Blut kann mithilfe eines bestimmten Farbstoffes erhöht werden.
Dieser Farbstoff wird Hämoglobin genannt und ist rot. Es gehört zu den Chromoproteiden. Das Hämoglobin liegt bei den Wirbeltieren in den Erythrocyten unterschiedlicher Größe vor.
Das Häm ist aus einem 2wertigen Eisenatom aufgebaut, das von einem Protoporphyrin-Ring umgeben ist. Die Hämoglobine der verschiedenen Wirbeltierarten unterscheiden sich in ihrer Kettenlänge der Peptide sowie in der Sequenz der Aminosäuren.
Im Tierreich ist der Farbstoff Hämoglobin das am weit verbreitesten unter den gesamten bekannten Fargbstoffe.

Material & Methoden
Ergebnisse

Versuch 1
Versuch 2

Es wurden drei Messungen durchgeführt und anschließend mit dem Mittelwert weitergerechnet.

Messung 1: 0,327
Messung 2: 0,318
Messung 3: 0,308

Mittelwert: 0,314

Berechnung der Hämoglobinkonzentration

Lambert-Beer'sches Gesetz: E = e * d * c (e = epsilon; Extinktionskoeffizient)
Zu c umgestellt: c = E/(e*d)

e = 44 ml/ymol*cm bei 540nm
d = 1 cm

c = 0,314 / (44ml/ymol*cm * 1 cm)
c = 7,15 * 10^-3 ml/ymol*cm

Berechnung des Wertes in g/l

M(MetHb-CN) = 68 kDa = 68 kg/mol = 68000 g/mol

7,23 * 10^-3 ymol/ml * 68000 g/mol = 7,23 ml * 68 yg
= 491, 64 yg/ml
= 491, 64 mg/l
= 0,491 g/l

Verdünnung rausrechnen:
0,491 g/l * 2/1 * 251/1 = 246 g/l

Die Hämoglobinkonzentration in der Probe beträgt 246 g/l
Normalwert: 120 - 170 g/l
--> haben mit einer konzentrierten Hämoglobinlösung gearbeitet (Blutprobe mit hochkonzentriertem Hämoglobin)

Versuch 3

Messung der Absoptionsspektren von
a) desoxygeniertem Hämoglobin (Hb)
b) oxygeniertem Hämoglobin (HbO2)
c) Mehtämoglobin (MethHb-CN, Hämiglobin)
(Zweiwertiges Eisen wird zu dreiwertigen oxidiert)

Geräte und Reagenzien: - Photometer
- Saponin-Lösung (0,5% Saponin, 0,5% NH4OH =Ammoniaklösung in H2O)
- Drabkin'sche Lösung
- Natriumdithionid
- Küvetten
(Saponinlösung/Seife/DEtergenz dient zum Zerstören der Membranen,
Drabkin'sche Lösung verbringt o. a. gen. drei Zustandsformen a) - c) in Methäm)

Durchführung
Es werden drei Küvetten beschriftet und die folgenden Lösungen vorgelegt:
- a) für HbO2 : 2,5 ml Saponinlösung
- b) für Hb : 2,5 ml Saponinlösung und eine Spatelspitze Dithionid
- c) für MetHb : 2,5 ml Drabkin'sche Lösung
- zum Einstellen des Photometers 2,5 ml Saponinlösung
Zu jeder Lösung werden 20 µl 1:2 verdünntes Erythrocytenkonzentrat zugegeben
(außer der Nullösung zum Einstellen des Photometers).

Es wird ausreichend invertiert und das Spektrum zweischen 480 und 650 nm im Photometer gemessen:

Auswertung:
Die Literaturwerte: Hb 555 nm, HbO2 577 nm und 541 nm, MethHb 546 nm
(Wellenlänge in nm / Absorption bzw. Extinktion)

Messung	Minimum	Minimum	Maximum	Maximum
ad a	(507/0,388)	(560/0,5)	541/0,697)	(575/0,682)
ad b	entf.	entf.	(558/0,734)	entf.
ad c	(501,5/0,275)	entf.	(542/0,527)	entf.

Festzustellen ist, daß die Messungen recht gut mit den gegebenen Literaturwerten übereinstimmen.

Diskussion:

Die unterschiedlichen Absorptionsmaxima kommen durch die jeweiligen Konformationsänderungen
der entsprechenden Form: oxygeniert, desoxygeniert vor.
Die O2-Aufnahme verändert die Wechselwirkung zwischen den Dimeren, was zu einer Änderung der
Konformation der O2-Bindungseigenschaften des Hämoglobinmoleküls fürht.
Im Hämoglobinmolekül ist Eisen als zweiwertiges Fe2+-Ion so in dem Porphyrinring des Häms eingegliedert,
daß es mit den vier Pyrrol-Stickstoffatomen koordinative Bindungen eingeht. Die beiden restlichen Koordinationsstellen
des Fe2+ dienen zur Bindung der Hämgruppe an ein O2-Molekül und an den Imidazolring eines Histidinrestes des Globins.
Solange Sauerstoff gebunden ist, wird das Molekül als Oxyhämoglobin bezeichnet, wenn Sauerstoff agegeben wurde,
als Desoxyhämoglobin.
Die Anlagerung des O2 an das Hämoglobin zur Bildung von Oxyhämoglobin ist keine Oxidation des Fe2+ zu Fe3+.
Eine Oxidation des zweiwertigen in dreiwertiges Eisen macht aus dem Hämoglobin Mehthämoglobin, welches keinen
Sauerstolff mehr binden kann und daher physiologisch funktionslos ist.

Diskussion
Literatur

- Physiologie, Ecker, Thieme-Verlag, 4. Auflage

Physiologie Protokoll Home

rockitgirl — Fri, 08 May 2009 07:59:30 CDT

Schaut in den verschiedenen Seiten da links rein und guckt auch immer unten an der Seite kann man diskutieren oder Dateinen anhängen.

zb. hab ich unter Lipide das Protokoll angehängt
und bei manchen seiten gibs ne diskussion!

Atmung

rockitgirl — Fri, 08 May 2009 07:48:42 CDT

Also hier mal das Inhaltsverzeichnis(welches ergänzt werden soll) mit denNamendes jeweiligen Bearbeiters dahinter..
Wir können das Protokoll auch direkt hier drin schreiben. Dafür hab ich noch einen Seite "Protokoll" unter der Atmung gemacht.

Einleitung

Hämoglobin

Wechselwarme Tiere
...

Material & Methoden

(was zu schreiben oder "siehe Seite XX-XX im Skript" ??)

Ergebnisse

Versuch 1 (Ines)
Versuch 2 (Julia)
Versuch 3 (Toni)

Diskurssion

Versuch 1 (Ines)
Versuch 2 (Julia)
Versuch 3 (Toni)

Zusammenfassung
Verwendete Literatur

Links

rockitgirl — Fri, 08 May 2009 07:40:47 CDT

Hier könnt ihr wichtige Links reinstellen .. die einem vieleicht helfen das Protokoll zubearbeiten.

Weiss wer wie die Adresse von Adlox war ?

Lipide

rockitgirl — Fri, 08 May 2009 07:22:14 CDT

Schaut mal ganz unten unter "Attachments" da ist das Protokol zu den Lipiden zufinden !

Fragen

rockitgirl — Fri, 08 May 2009 07:11:31 CDT

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